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1.Western Blot检测样本要求
新鲜的样品，组织（植物组织、动物组织）、细胞，由信诺金达负责提取蛋白。
组织样品：提供250-500mg新鲜样品/样；
细胞样品：提供1×106～1×107细胞/样；
以上样品均需要干冰运输。
注：贴壁细胞的处理方法（冰上操作）
1) 转染后的细胞，细胞刮直接刮下来，PBS重悬清洗，吹洗后离心（5000 rpm，4min）去上清-20℃保存，避免反复冻融。
2) 裂解液裂解，裂解后离心（12000 rpm，4min），取上清。
2.Western Blot检测中为什么检测无信号？（白板）
大概总结为一下几类原因：
（1）样品中目的蛋白丰度很低，低于实验的检测下限
（2）一抗不识别检测物种的蛋白，同时若有阳性参照的话提供阳性对照蛋白，若阳性对照正常则说明抗体及实验参照没有问题，可能是样本中目的蛋白含量比较低。
（3）蛋白降解
(4）待测样品的确为阴性；
（5）一抗失效；
（6）抗原量不足，每泳道蛋白上样量不低于0.1ug。
3.Western Blot检测中为什么选择内参？
内参也叫看家基因，在组织或细胞中都会表达，且表达量在不同组织或细胞中几乎是相同的，一般有α-Tublin，β-actin，GAPDH等，在Western Blot中使用内参其实就是在Western Blot过程中用内参对应的抗体检测内参。
其作用有两个:
（1）看提取蛋白质量的好坏。如果做western的时候，内参蛋白有条带，而目的蛋白没有，说明蛋白的提取和转膜等步骤没有问题，是目的蛋白的抗体质量不好或者是稀释倍数不对。
（2）比较客观的说明目的蛋白的表达情况，消除上样量等的误差。不同的样品之间由于蛋白提取的量有差别，可能强阳性的表达跑出来的带很弱。
因此设立内参照，比较不同样品之间的表达情况。
3.Western Blot检测中为什么内参条带不一致？
这个是正常现象。理论上，目的蛋白在对应总蛋白中的比例大致相同，内参和目的蛋白的比例也在相应组保持一致。同样的，内参不一致的时候，上样总蛋白量相同，但目的蛋白（内参蛋白）在不同样品中提取后的内参蛋白量不一定是完全一致的，所以在进行Western Blot定量分析时会通过内参进行校正分析，最终获得相对的表达量的分析结果。
4.Western Blot检测中为什么检测的结果分子量大小与实际不符？
（1）翻译后修饰—比如蛋白的磷酸化，糖基化等，这些都会增加蛋白的分子量大小。
（2）翻译后剪切—比如很多蛋白首先被合成为前体形式，然后通过剪切获得生物学活性。
（3）剪接变异体—相同的基因，经过选择性剪接会产生不同分子量大小的蛋白。
（4）相对电荷—氨基酸的组成 (带电 vs 不带电)。
（5）多聚体—比如蛋白二聚体。
5.为什么检测结果有很多杂带？
(1)可能是样品本身体内表达的蛋白具有多种修饰形式如糖基化、磷酸化、乙酰化等；
(2)若是细胞样品，可能是细胞传代次数过多，使其蛋白表达不同，可以使用传达次数少的进行平行实验一起做对照看看；
(3)蛋白降解，导致蛋白分子量降低；
(4)蛋白形成多聚体形式。
6.为什么Western Blot检测的背景比较高？
(1)可能抗体浓度较高；
(2)抗原量较大；
(3)一张膜中有的目的条带较弱，为了能让较弱条带显示出来，曝光时间较长。
7.为什么Western Blot的结果与QPCR结果趋势不一样？
这种情况是比较正常的， Western Blot反映的是蛋白水平的结果， qPCR反映的是基因水平的结果。理论上蛋白水平与基因水平是一致的，但是mRNA的高低不代表其表达蛋白的高低。
也有一些基因可能在组织样品中没有正常翻译，这样即使qPCR检测结果有表达，但是若蛋白没有正常翻译的话，Western Blot则检测不到目的条带。
相关连接：
Western Blot检测
荧光定量PCR检测
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