荧光定量PCR(qPCR)就是在PCR扩增过程中,通过荧光信号,对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期,模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系,所以成为定量的依据。由于常规的PCR的缺点,
荧光定量PCR( qPCR)由于其操作简便,灵敏度高,重复性好等优点发展非常迅速。设在已经涉及到生命科学研究的各个领域,比如基因的差异表达分析,SNP检测,等位基因的检测,药物开发,临床诊断,转基因研究等。
我想做过
荧光定量PCR(qPCR)的研究者用过的仪器也无怪乎ABI 7000、7300、7500,7700、7900HT、StepOnePlus TM、StepOne TM、PRISM? StepOne TM系列;BIO-RAD的CFX96、iCycler iQ5?、MyiQ?、MJ Research Chromo4 TM Opticon系列;Stratagene Mx TM系列;Roche LightCycler?系列;Eppendorf Masercycler?;Corbett Rotor-Gene TM;Cepheid SmartCycler? 和BIOER 的LineGene系列。其仪器的设置和数据输出方式基本类似,相差不大。
有过qPCR实验经验的研究者可能很快就能熟悉其不同于PCR的结果Ct值,以及数据的常用运算方法比较Ct方法(2-△△Ct)。那么这个数据到底有没有统计意义呢?这个该如何分析?我们来逐渐了解相对定量qPCR的数据统计分析。
首先在数据分析之前,要确保数据的准确性,也就是实验过程的各个部门都要严格操作,也就是
MIQE标准(具体可见Bustin SA et al Clin Chem 55,611-622 2009)。这些都做到了,那么就可以来分析Ct数据了。
统计分析,至少有3个数据才可以。那就是在设计实验中,每组至少要有3个生物学重复(也就是3个不同的样本)。这个和qPCR的3个PCR replicate是完全不同的概念(这儿是同一个样本的3个重复)。
下面我们就以一个处理分析的实验来做说明如何来数据统计分析。1个处理组和1个对照组,每组有3个样本(也就是生物学重复),来检测某目的基因(target,设定内参基因为reference),在这个处理中,目的基因的表达是否受到抑制?同时这个抑制作用是否有统计学意义。
不管是哪个qPCR仪,都可以做此检测,数据也都可以用excel表归纳如下:
Group |
Sample |
Ct target |
Ct mean of T |
Ct reference |
Ct mean of R |
CON |
sample1 |
22.89 |
22.90 |
15.29 |
15.63 |
22.82 |
15.91 |
23.00 |
15.69 |
sample2 |
22.60 |
22.64 |
15.83 |
15.60 |
22.46 |
15.71 |
22.85 |
15.27 |
sample3 |
22.49 |
22.53 |
14.81 |
14.98 |
22.49 |
14.79 |
22.60 |
15.34 |
TRT |
sample1 |
25.32 |
25.31 |
14.98 |
15.18 |
25.40 |
15.33 |
25.20 |
15.22 |
sample2 |
25.70 |
25.60 |
15.46 |
15.38 |
25.50 |
15.45 |
25.61 |
15.22 |
sample3 |
25.49 |
25.60 |
15.25 |
15.05 |
25.68 |
14.6 |
25.64 |
15.29 |
首先每个样品的目的基因和内参基因的3个PCR replicate要求出平均值,这个仅仅是技术重复,也就是确定这个数据是可靠的。然后求出在每个样品的目的基因的变化量也就是(目的基因的量和其对应的内参基因的量相比,也就是2-△Ct)。然后再平均对照组中的3个2-△Ct,在此例子中数据为0.006482,然后所有2-△Ct的都和0.006482相比即可到2-△△Ct,也就是倍数变化(fold change或者relative expression)。
下面就可以对2-△△Ct或者2-△Ct或者就行统计分析,Ct的2种形式都可以进行统计分析,唯独不能对Ct进行统计分析。具体统计分析的方法,任何统计分析软件都可以用比如SPSS,GraphPad等。这里展示一下GraphPad分析的结果。
Group |
Sample |
Ct target |
Ct mean of T |
Ct reference |
Ct mean of R |
2-△Ct |
2-△△Ct |
CON |
sample1 |
22.89 |
22.90 |
15.29 |
15.63 |
0.006464 |
0.99724 |
22.82 |
15.91 |
23.00 |
15.69 |
sample2 |
22.60 |
22.64 |
15.83 |
15.60 |
0.007634 |
1.17773 |
22.46 |
15.71 |
22.85 |
15.27 |
sample3 |
22.49 |
22.53 |
14.81 |
14.98 |
0.005348 |
0.82512 |
22.49 |
14.79 |
22.60 |
15.34 |
TRT |
sample1 |
25.32 |
25.31 |
14.98 |
15.18 |
0.000892 |
0.13768 |
25.40 |
15.33 |
25.20 |
15.22 |
sample2 |
25.70 |
25.60 |
15.46 |
15.38 |
0.000835 |
0.12875 |
25.50 |
15.45 |
25.61 |
15.22 |
sample3 |
25.49 |
25.60 |
15.25 |
15.05 |
0.000664 |
0.10243 |
25.68 |
14.6 |
25.64 |
15.29 |
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