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如何对荧光定量PCR(qPCR)数据进行统计分析
   荧光定量PCR(qPCR)就是在PCR扩增过程中,通过荧光信号,对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期,模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系,所以成为定量的依据。由于常规的PCR的缺点,荧光定量PCR( qPCR)由于其操作简便,灵敏度高,重复性好等优点发展非常迅速。设在已经涉及到生命科学研究的各个领域,比如基因的差异表达分析,SNP检测,等位基因的检测,药物开发,临床诊断,转基因研究等。
  我想做过 荧光定量PCR(qPCR)的研究者用过的仪器也无怪乎ABI 7000、7300、7500,7700、7900HT、StepOnePlus TM、StepOne TM、PRISM? StepOne TM系列;BIO-RAD的CFX96、iCycler iQ5?、MyiQ?、MJ Research Chromo4 TM Opticon系列;Stratagene Mx TM系列;Roche LightCycler?系列;Eppendorf Masercycler?;Corbett Rotor-Gene TM;Cepheid SmartCycler? 和BIOER 的LineGene系列。其仪器的设置和数据输出方式基本类似,相差不大。有过qPCR实验经验的研究者可能很快就能熟悉其不同于PCR的结果Ct值,以及数据的常用运算方法比较Ct方法(2-△△Ct)。那么这个数据到底有没有统计意义呢?这个该如何分析?我们来逐渐了解相对定量qPCR的数据统计分析。
  首先在数据分析之前,要确保数据的准确性,也就是实验过程的各个部门都要严格操作,也就是MIQE标准(具体可见Bustin SA et al Clin Chem 55,611-622 2009)。这些都做到了,那么就可以来分析Ct数据了。
  统计分析,至少有3个数据才可以。那就是在设计实验中,每组至少要有3个生物学重复(也就是3个不同的样本)。这个和qPCR3PCR replicate是完全不同的概念(这儿是同一个样本的3个重复)。
  下面我们就以一个处理分析的实验来做说明如何来数据统计分析。1个处理组和1个对照组,每组有3个样本(也就是生物学重复),来检测某目的基因(target,设定内参基因为reference),在这个处理中,目的基因的表达是否受到抑制?同时这个抑制作用是否有统计学意义。

  不管是哪个qPCR仪,都可以做此检测,数据也都可以用excel表归纳如下:

Group

Sample

Ct target

Ct mean of T

Ct reference

Ct mean of R

CON

sample1

22.89

22.90

15.29

15.63

22.82

15.91

23.00

15.69

sample2

22.60

22.64

15.83

15.60

22.46

15.71

22.85

15.27

sample3

22.49

22.53

14.81

14.98

22.49

14.79

22.60

15.34

TRT

sample1

25.32

25.31

14.98

15.18

25.40

15.33

25.20

15.22

sample2

25.70

25.60

15.46

15.38

25.50

15.45

25.61

15.22

sample3

25.49

25.60

15.25

15.05

25.68

14.6

25.64

15.29

  首先每个样品的目的基因和内参基因的3个PCR replicate要求出平均值,这个仅仅是技术重复,也就是确定这个数据是可靠的。然后求出在每个样品的目的基因的变化量也就是(目的基因的量和其对应的内参基因的量相比,也就是2-△Ct)。然后再平均对照组中的3个2-△Ct,在此例子中数据为0.006482,然后所有2-△Ct的都和0.006482相比即可到2-△△Ct,也就是倍数变化(fold change或者relative expression)。   下面就可以对2-△△Ct或者2-△Ct或者就行统计分析,Ct的2种形式都可以进行统计分析,唯独不能对Ct进行统计分析。具体统计分析的方法,任何统计分析软件都可以用比如SPSS,GraphPad等。这里展示一下GraphPad分析的结果。

Group

Sample

Ct target

Ct mean of T

Ct reference

Ct mean of R

2-Ct

2-△△Ct

CON

sample1

22.89

22.90

15.29

15.63

0.006464

0.99724

22.82

15.91

23.00

15.69

sample2

22.60

22.64

15.83

15.60

0.007634

1.17773

22.46

15.71

22.85

15.27

sample3

22.49

22.53

14.81

14.98

0.005348

0.82512

22.49

14.79

22.60

15.34

TRT

sample1

25.32

25.31

14.98

15.18

0.000892

0.13768

25.40

15.33

25.20

15.22

sample2

25.70

25.60

15.46

15.38

0.000835

0.12875

25.50

15.45

25.61

15.22

sample3

25.49

25.60

15.25

15.05

0.000664

0.10243

25.68

14.6

25.64

15.29

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 




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