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Western Blot原理介绍
Western Blot（WB），即蛋白免疫印迹法，是定性、定量检测蛋白表达的一种经典、有效的技术方法。western blot是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。Western blot是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。由于western blot具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，现已成为蛋白分析的一种常规技术。Western blot常用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析。
Western Blot方法非常成熟，大多实验室均具备Western Blot的实验能力。但是要得到一份背景清晰、条带明亮、真实客观的实验结果，需要投入大量的时间和精力，信诺金达生物技术人员，在样品处理、转印和抗体稀释比例等操作上具有特殊的技巧，能够为客户的样品量身定制实验方案。
Western Blot技术路线
Western Blot服务优势
1. 高分辨率的电泳技术：聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel，PAGE）把分子筛作用和电荷效应结合在同一方法中，达到更高的灵敏度。
2. 特异敏感的抗原-抗体反应：抗原抗体的结合实质上是抗原表位与抗体超变区中抗原结合点之间的结合。由于两者在化学结构和空间构型上呈互补关系，所以抗原与抗体的结合具有高度的特异性。
3. 1-5ng中等大小的靶蛋白：可检测到低至1～5ng（最低可到10～100pg）中等大小的靶蛋白。
Western Blot服务要求
需新鲜或正确保存的蛋白样品或者蛋白粗提液（总蛋白浓度不低于 2μg/μl（至少50μl）。）；或者不少于50mg组织样品，或者不少于5×10的6次方个细胞的细胞样品。
阳性对照样品（如果有）。
检测目的蛋白的一抗（自备或者如果是常用的信诺金达会有备货，不常用的可由信诺金达订购）。
Western Blot步骤
1、蛋白质抽提
A、实验对象为组织样品，取适量（250-500mg）新鲜组织样品，加1ml含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂（或核蛋白抽提试剂），匀浆后抽提总蛋白。
B、实验对象为细胞样品，每份样品取1×10的6次方～1×10的7次方细胞，PBS清洗细胞，去PBS加0.1ml~1ml含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂（或核蛋白抽提试剂）抽提总蛋白。
2、蛋白质定量
按KCTMBCA蛋白质定量试剂盒操作说明操作，测定样品浓度。
3、变性聚丙烯酰胺不连续凝胶电泳(SDS-PAGE)
将准备好的样品液和生物素标记的蛋白质分子量标准分别上样，标准加进第一个孔中，电泳分离蛋白。
4、蛋白质转移到硝酸纤维膜或PVDF膜
5、膜的封闭和抗体孵育
A、膜在5％BSA溶液中室温孵育1小时以封闭膜上的非特异结合。
B、封闭过的膜加入一级抗体室温孵育1.5小时，抗原抗体结合。
C、加入HRP标记的二级抗体以结合一级抗体及HRP标记的抗生物素抗体以结合分子量标准，室温孵育膜1小时。加入HRP标记的GAPDH抗体可同时检测GAPDH含量。
6、结果检测
化学发光法检测，膜与化学发光底物孵育，经X胶片曝光显影。图片扫描保存为电脑文件，并用ImageJ分析软件将图片上每个特异条带灰度值的数字化。
7、数据分析
目的蛋白的灰度值除以内参GAPDF的灰度值以校正误差，所得结果代表某样品的目的蛋白相对含量。
8、提供实验报告
包括详细的实验方法及Western Blot实验结果。
Western Blot实验交付内容
实验交付内容包括：蛋白浓度，胶片，膜，以及灰度分析（如果需要）及实验报告。
实验范例图片： 
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